home *** CD-ROM | disk | FTP | other *** search
/ Shareware Overload Trio 2 / Shareware Overload Trio Volume 2 (Chestnut CD-ROM).ISO / dir26 / mbompat.zip / MBOMPAT.TXT
Text File  |  1994-07-17  |  13KB  |  298 lines
  1.  
  2.                PLANTS - PATHOGENIC MICROBES MODULE EXAMPLES
  3.  
  4. test organisms
  5.  
  6.      Xanthomonas campestris pv. campestris
  7.           
  8. /end
  9.  
  10.      
  11. source of donor DNA
  12.  
  13.      V. fischeri - luminescent bacteria
  14.  
  15. /end
  16.  
  17.  
  18. vector(s)
  19.  
  20.      The transposon, Tn4331, was used to construct bioluminescent
  21.      strains of the bacterium.  This transposon carries the lux
  22.      genes in a manner which facilitates transcriptional fusion
  23.      of the genes into the bacterial chromosomal DNA.
  24.  
  25.      Vector or vector agent:  Organisms or objects used to
  26.      transfer genetic material from the donor organism to the
  27.      recipient organism.  Well-characterized and contain only
  28.      non-coding regulatory regions. (e.g. operators, promoters,
  29.      origins of replication, terminators and ribosomes binding
  30.      regions).  The genetic material added to a microorganism in
  31.      which the following can be documented about such genetic
  32.      material:  (a) The exact nucleotide base sequence of the
  33.      regulatory region and any inserted flanking nucleotides; (b)
  34.      The regulatory region and any inserted flanking nucleotides
  35.      do not code for protein or peptide; and (c) The regulatory
  36.      region solely controls the activity of other sequences that
  37.      code for protein or peptide molecules or act as recognition
  38.      sites for the initiation of nucleic acid or protein
  39.      synthesis.
  40.  
  41. /end
  42.  
  43.  
  44. other genetic sequences
  45.  
  46.      Another gene complex, besides the luciferase genes and the
  47.      transposon, is incorporated into the chromosomal DNA after
  48.      transformation.  The tetracycline resistance gene complex
  49.      functions only as a marker in the initial cell selection
  50.      process following transformation.  Neither of the marker
  51.      genes nor the resultant enzyme products have any inherent
  52.      plant pest characteristics. 
  53.  
  54. /end
  55.  
  56.  
  57. exact location(s)
  58.  
  59.      The experiment will be conducted on a research farm owned by
  60.      (Institution Name).  It is located on a secondary road in
  61.      (county), (state).  This is XX.XX miles from (city), the
  62.      nearest population center.
  63.                             
  64. /end
  65.  
  66.  
  67. summary statement
  68.  
  69.      Pursuant to regulations in 7 CFR Part 340 we propose to
  70.      field test X. campestris pv. campestris which has been
  71.      modified to express the luciferase gene complex.  The genes
  72.      were inserted into the bacterial chromosomal DNA using a
  73.      suicide vector system.  The field trial wiil take place on a
  74.      small plot on agricultural land in (county), (state).  The
  75.      farm will provide adequate physical security.  Site
  76.      monitoring of the field trial and agronomic management      
  77.      practices that create a nonpropogative environment are      
  78.      expected to provide the necessary degree of both biological
  79.      and physical containment.
  80.      
  81. /end
  82.  
  83.         
  84. purpose
  85.      
  86.      X. campestris pv. campestris has been genetically modified
  87.      to express the luciferase gene complex.  Limited field
  88.      testing is necessary so that information can be gathered for
  89.      scientific evaluation of the efficacy of the genetic change. 
  90.      The bacterium has been tested in the greenhouse to obtain
  91.      initial data relating to the genetic stability of the
  92.      engineered genes and preliminary data on light production.
  93.      Field tests are performed after greenhouse testing to
  94.      confirm the data, which can only be validated in the
  95.      environment using standard agricultural practices.
  96.  
  97. /end
  98.  
  99. description of the methods
  100.  
  101.      A detailed description of the transposon Tn4331 delivery
  102.      system is described by Shaw et al. (1988).  Briefly, Tn4331,
  103.      a member of the Tn3 family (Sherratt, 1988), was transferred
  104.      to X. campestris pv. campestris 2D520 in a biparental mating
  105.      with Escherichia coli containing the suicide transposon
  106.      delivery plasmid, pUCD623 (a derivative of pSa235).  Plasmid
  107.      pSA325 does not replicate in X. campestris pv. campestris,
  108.      but can be transferred into X. campestris pv. campestris due
  109.      to the fertility functions provided.  This fact makes it an
  110.      ideal suicide delivery system.  Plasmid pUBD623 (Figure
  111.      1) was constructed by allowing Tn4331 to insert into pSA325.
  112.      Plasmid pUCD623 can be transferred into X. campestris pv.
  113.      campestris from E. coli but cannot replicate.  Upon
  114.      introduction of pUCD623 into X. campestris pv. campestris,
  115.      select sequences were introduced into Xanthomonad
  116.      chromosomal DNA.
  117.  
  118. /end
  119.  
  120.  
  121. amount and nature
  122.  
  123.      Vector/Donor DNA Remaining Mutants containing these
  124.      sequences (i.e. transposon Tn4331, tetracycline resistance
  125.      marker, and luciferase) were found (as expected) to be
  126.      tetracycline resistant and bioluminescent.  To verify that
  127.      only the tetracycline resistance marker and the lux gene
  128.      complex and no other plasmid sequences retained by the
  129.      mutants, a limited number of exconjugants were
  130.      demonstrated to be sensitive to ampicillin and
  131.      chloramphenicol.  A further verification, colony
  132.      hybridization of a limited number of exconjugants
  133.      demonstrated that the mutants had acquired DNA homologous
  134.      to the transposon and had not retained portions of the
  135.      plasmid vector pSa325.
  136.  
  137. /end
  138.  
  139. containment procedures
  140.  
  141. Information obtained during studies of the modified pathogenic
  142. organism in containment (e.g. microcosm, greenhouse, growth
  143. chamber) is crucial.  Containment conditions that most closely
  144. imitate field situations will provide the best idea as to the
  145. potential field performance of the test organism.  For example,
  146. containment studies for soilborne transformed microbes should
  147. include tests using soil from the proposed release site.  If the
  148. methods of monitoring and identifying pathogenic biotypes are
  149. well established, provide details (include information on
  150. the previous use of these methods).
  151.  
  152. Studies conducted under containment conditions comparing the
  153. genetically engineered organism with the non-modified parent
  154. organism are recommended prior to field testing.  Some of the
  155. topics you may wish to address include:
  156.    1. Phenotype.
  157.    2. Physical characteristics, e.g., colony morphology.
  158.    3. Serology.
  159.    4. What genes do the recombinants express differently from the
  160.       parent and what is the manifestation of this expression.
  161.    5. Persistence in the environment.
  162.    6. Effects on pathogenicity.  Provide a brief description.
  163.  
  164. Example - Studies in Containment
  165.  
  166.      The recombinant has a slower doubling time than its parental
  167.      strain.  In vegetable, the recombinant is less virulent and
  168.      its population levels reached is approximately 100-fold less
  169.      than its parental strain.  Based on current knowledge on the
  170.      genetic basis of host range determinants in Xanthomonads
  171.      (Daniels et al., 1987; Turner et al., 1985; Keen and
  172.      Staskawicz, 1988), the recombinant X. campestris pv.
  173.      campestris could not have a wider host range than the
  174.      parental bacterium.
  175.  
  176.      Host and Alternate Hosts.  The natural host range of X.
  177.      campestris pv. campestris is generally limited to the
  178.      Brassica family.  Many weeds can harbor the bacterium
  179.      including Brassica campestris, B. nigra, B. geniculata,
  180.      Lepidium virginicum, and Cardaria pubescens (Sherf and
  181.      MacNab, 1986).  Schaad and Dianese (1981) demonstrated that
  182.      in Georgia, X. campestris pv. campestris was found on the
  183.      weeds B. campestris, Lepidium virginicum, Cornopus didymud,
  184.      and Raphanus sativus.  They also demonstrated that X.
  185.      campestris pv. campestris was disseminated up to 12 meters
  186.      from infected weeds to cabbage.  Laboratory and greenhouse
  187.      studies in soil survival at different moisture regimes have
  188.      shown that populations of X. campestris pv. campestris
  189.      declined very slowly in soils maintained at low moisture
  190.      levels (-30 bars).  In contrast, populations declined more
  191.      rapidly in soils maintained at higher moisture levels and
  192.      were quickly eliminated from soils maintained near field
  193.      capacity (-0.1 bar).  The pathogen could no longer be
  194.      recovered from moist soils 6 days after adding the inoculum,
  195.      whereas 95 percent of the initial inoculum could be detected
  196.      in dry soils after infestation (Alvarez et al., 1987).
  197.  
  198. /end
  199.  
  200.  
  201. transmitted to other species
  202.  
  203.      Stability of Vector and/or Other Genetic Sequences.
  204.      The recombinant bacterium has no detectable plasmids,
  205.      reducing the likelihood that the lux genes or other
  206.      introduced genes could transfer to a conjugal plasmid and
  207.      subsequently vectored to new bacterial hosts.  This strain
  208.      has been refractory to conjugation manipulation under
  209.      laboratory conditions.  The recombinant has been
  210.      demonstrated to be stable in vegetable.  Plants were
  211.      inoculated with the recombinant, allowed to grow and disease
  212.      progressed.  Bacteria from this infected plant was used as
  213.      inoculum for another plant and this procedure repeated once
  214.      again.  X. campestris pv. campestris was isolated from the
  215.      last infected plant and greater than 99 percent of the
  216.      bacterial colonies were bioluminescent and tetracycline
  217.      resistant (Shaw, unpublished).
  218.  
  219. /end
  220.  
  221. effects on human health
  222.  
  223.      No potential impact on people living in the area of the
  224.      field test, or any other human population, can be
  225.      identified.  Xanthomonads are not known to be human or
  226.      animal pathogens (Starr, 1981).
  227.     
  228. /end
  229.  
  230. design of the experiment
  231.  
  232.      The main plot will be divided into four subplots.  Each
  233.      subplot will consist of 4 rows of plants, 18 inches apart,
  234.      with each row about 6 feet in length.  A disposal area will
  235.      be located adjacent to the main plot.  An unplanted area
  236.      will surround the main plot and disposal areas.  Surrounding
  237.      the unplanted area will be a single row of cabbage or
  238.      cauliflower.  These plants will be monitored for the
  239.      presence of the recombinant X. campestris pv. campestris
  240.      during the growing season.  The total plot size, including
  241.      the perimeter row, will not exceed 6,000 square feet.  The
  242.      plant varieties are the susceptible hosts:  snowball
  243.      cauliflower (B. oleracea L. boytrytis) and perfect ball
  244.      cabbage (B. oleracea L. capitata).  Plants will be
  245.      inoculated by:  stabbing or injecting bacterial suspensions
  246.      into the petioles, or spraying a bacterial suspension over
  247.      the plant with a hand-held spray bottle.
  248.  
  249. /end
  250.  
  251.  
  252. monitoring plan
  253.  
  254.      During the field test, university scientists will monitor
  255.      the field plots regularly.  Plant parts, debris, and soil
  256.      will be sampled periodically for X. campestris pv.
  257.      campestris.  Samples will be placed in small bags or small
  258.      containers and transported to the laboratory under contained
  259.      conditions (7 CFR 340.6).  At the laboratory they will be
  260.      analyzed for light production ability and/or the presence of
  261.      viable recombinant X. campestris pv. campestris.  The
  262.      recombinant X. campestris pv. campestris under appropriate
  263.      conditions produces light.  This light production ability
  264.      allows the movement and spread of the bacterium in the
  265.      environment to be monitored.  Plant disease index will be
  266.      recorded and correlated with the location of the
  267.      recombinant.
  268.  
  269.      Procedures for Sample Processing
  270.      Soil inoculations with recombinant will involve small
  271.      amounts of bacteria (less than 100 ml of stationary
  272.      culture).  The bacteria will be mixed with soil and then the
  273.      mixture will be buried into the soil.  Alternately, infected
  274.      plant parts (from laboratory or field) will be buried in the
  275.      soil.  Areas so inoculated will be marked by a flag and
  276.      periodically sampled for bacteria and bioluminescence. 
  277.  
  278. /end
  279.  
  280. Termination of the Experiment
  281.  
  282.      At the conclusion of the experiment, all plant material
  283.      remaining at the test site will be incorporated into the
  284.      soil and the test site watered thoroughly for 1 week.  Plant
  285.      parts and soil removed from the test site for laboratory
  286.      analysis will be autoclaved prior to disposal.  Plant
  287.      samples removed during the course of the experiment
  288.      and not autoclaved will be returned to the test site and
  289.      buried in the disposal area to allow for natural
  290.      decomposition.  Survival of the recombinant bacterium in
  291.      soil will be minimized by irrigating the field after
  292.      termination of the experiment.  Irrigation of the field will
  293.      also encourage decay of plant debris.  There is no evidence
  294.      showing prolonged survival of Xanthomonads in irrigation
  295.      water.
  296.  
  297. /end
  298.